Difference between revisions of "Analyse des macrophages"

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| Title in English = Analysis of mouse macrophages "J774" by Raman and Infrared vibrational spectroscopies
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| Title in English = Analysis of macrophages
| Title in French = Analyse des macrophages de souris "les J774" par spectroscopies vibrationnelles Raman et Infrarouge
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| Title in French = Analyse des macrophages
 
| Contact = Sana Tfaili
 
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Latest revision as of 16:20, 10 October 2019

Project
Contact Sana Tfaili
Keywords J774
Organization Lip(Sys)2
Méthode générale Analyse des macrophages méthode 1
Analyse des macrophages méthode 2

Résumé

De nombreux travaux des biologistes de Lip(Sys)² se sont intéressés à l'impact de l'incorporation membranaire d'acide gras trans dans les membranes de J774 et de HMDM. Cette surcharge a pour conséquence une diminution de la capacité d'efflux de cholestérol via le transporteur ABCA1 dont l'expression et la localisation membranaire ne sont pas modifiées mais dont l’activité ATPasique, indispensable à son fonctionnement, est nettement diminuée [1]. Les conséquences de l'incorporation d'acide gras ω3 et de LDL modifiées au niveau de la composition des phospholipides membranaires ont été étudiées par spectrométrie de masse.
L'objectif de ce travail consistera en premier lieu à optimiser l'imagerie des macrophages J774 par spectroscopie vibrationnelle [2] [3] [4]. L'acquisition des images spectrales sera réalisée en Raman et en infrarouge. Après cette étape d'optimisation, une étude comparative sera menée entre des J774 non surchargés et des J774 surchargés. A travers cette étude et en s'appuyant sur le traitement de données, nous souhaiterions identifier des modifications spectrales suite à la surcharge en acide gras des J774.

Préparation de l'échantillon pour les analyses ultérieures en Raman et en infrarouge IR

Cellules non surchargées par des LDL acetylees (6 Lames)

Les cellules sont ensemencées sur lames de CaF2 dans des plaques de culture de 6 puits (dimension 9,6 cm2 / puits) à une concentration de 10 x 104 cellules/mL/puits. Les macrophages sont ensuite entretenus et incubées à 37°C et à 5% CO2 dans 2 mL de milieu de culture complet par puits. Après 72h, le milieu de culture complet est remplacé par le milieu standard STD dans trois puits (3 lames) et par le milieu additionné d’acide éicosapentanoïque EPA (Cayman Chemical Company, USA) à 70µM dans les trois puits restants (3 lames). Après 30h d’incubation, les milieux sont remplacés par 2 mL du milieu BSA-serum free medium dont la composition est la suivante : RPMI, 1% Glu, HEPES et P-S et enrichi à 0,2% en BSA: ce milieu ne contient pas de SVF.

Cellules surcharges en LDL acetylees (6 Lames)

Les cellules sont ensemencées en suivant les mêmes étapes précisées ci -dessus avec une concentration de 7,5x104 cellules/mL/puits. Après 72h, le milieu de culture complet est remplacé dans la moitié des puits par le milieu standard STD et par le milieu additionné d’acide éicosapentanoïque EPA (70µM) dans l'autre moitié. Ensuite, les milieux sont remplacés après 30h d’incubation par des milieux STD et EPA surchargées en LDL acétylées à 75 µg/mL. Trente heures après, ces milieux sont remplacés par le BSA-serum free medium.

Fixation des cellules sur les lames CaF2

Les lames CaF2 sont récupérées des puits et les cellules sont fixées en laissant agir 2 à 3 mL de paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant quinze minutes. Ensuite le PFA est aspiré et les lames sont lavées au PBS (phosphate Buffered saline) puis à l’eau distillée. Un premier lavage au PBS (1,5 à 2 mL) permet d’éliminer toute trace de milieu de culture. Ensuite, 3 lavages à l’eau distillée en remplissant les 2/3 des puits permettent d’éviter le dépôt des cristaux de PBS.


Références

  1. N. Fournier, N. Attia, D. Rousseau-Ralliard, B.t. Vedie, F.d.r. Destaillats, A. Grynberg, J.-L. Paul, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids 1821 (2011) 303.
  2. H.J. Byrne, P. Knief, M.E. Keating, F. Bonnier, Chem Soc Rev 45 (2015) 1865.
  3. F. Draux, C. Gobinet, J. Sule-Suso, M. Manfait, P. Jeannesson, G.D. Sockalingum, Analyst 136 (2011) 2718.
  4. F. Draux, P. Jeannesson, A. Beljebbar, A. Tfayli, N. Fourre, M. Manfait, J. Sule-Suso, G.D. Sockalingum, Analyst 134 (2009) 542.